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Western blotting

Western Blotting试验

 

    免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

InTech western blot 技术优势:

1、InTech关于wb实验完整的产品线,从相关耗材到试剂抗体,涵盖wb全部实验相关产品。

2、InTech通过对样本进行蛋白定量,内参控制等方法严格均一化各样本蛋白量,真实呈现蛋白表达差异性;

3、InTech拥有多年的Western Blot检测经验,为客户提供专业的技术服务和全套的western blot 解决方案。

InTech Western blot 实验流程:

1、蛋白提取和定量(如果提供蛋白样品,则直接电泳预实验检测抗体特异性);

2、SDS-PAGE 10-15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;

3、转膜(PVDF膜);

4、封闭(5%脱脂奶粉);

5、一抗孵育(其中内参基因为Tubulin、GAPDH或b-Actin);

6、二抗孵育(若由于样本降解或一抗质量造成实验无法继续,则收取相关预实验费用);

7、显色(ECL);

8、曝光、洗片、分析。

 InTech建议western blot样本搜集和保存方法:

1、悬浮细胞样品


    把细胞及培养液一起收集到15 ml或者50 ml离心管中,1 500 rpm离心3 min,弃去上清;加入10 ml 冷PBS轻轻吹打,1 500 rpm,4℃离心3 min,弃去上清;反复2次;第二次弃去上清后,用1 ml 冷PBS重悬细胞,移入1.5 ml微型离心管,2 500 rpm(500 g),4℃离心5分钟,尽量去除所有残留上清,于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下,一般保存1年,建议尽快检测。

2、贴壁细胞样品-----样本需求量106的细胞数较益。

2.1 胰酶消化


    用胰酶将细胞消化后,含血清的培养基中和胰酶,吹打,收集到15 ml或者50 ml离心管中,1 500 rpm离心3 min,弃去上清;加入10 ml 冷PBS轻轻吹打,1 500 rpm,4℃离心3 min,弃去上清;反复2次;第二次弃去上清后,用1 ml 冷PBS重悬细胞,移入1.5 ml微型离心管,2 500 rpm(500 g),4℃离心5分钟,尽量去除所有残留上清,于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下,一般保存1年,建议尽快检测。

2.2 细胞刮子收集细胞


    对于某些蛋白(即对胰酶比较敏感或者实验特殊要求,如E-Cadherin不易用胰酶消化后进行WB检测),直接用细胞刮子刮下细胞,连同培养基收集到15 ml或者50 ml离心管中,1 500 rpm离心3 min,弃去上清;加入10 ml 冷PBS轻轻吹打,1 500 rpm,4℃离心3 min,弃去上清;反复2次;第二次弃去上清后,用1 ml 冷PBS重悬细胞,移入1.5ml微型离心管,2 500 rpm(500 g),4℃离心5分钟,尽量去除所有残留上清,于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下,一般保存1年,建议尽快检测。

3、动物组织样品---湿重100mg以上较益;


    取下合适的动物或者人的组织样品后用预冷的PBS或者生理盐水漂洗,尽量除尽残留血液,用滤纸把多余PBS吸取干净。把组织分成约50mg大小(依据实验目的需要进行调整),用锡纸分别包装好或者用冻存管装好,于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。

4、植物样品


    取得待测植物样品后,用蒸馏水把泥土漂洗干净,用滤纸把多余水分吸取干净,分装成合适大小于-80度或者液氮中保存。在避免冻融的情况一般保存1年,建议尽快检测。

5、细菌样品


    细菌培养完成后,10 000rpm离心5 min收集细菌,加入PBS吹打,10 000rpm离心5 min,弃去上清;反复3次,弃去上清后于-80度或者液氮冻存待用。

6、若要检测磷酸化蛋白,请在3个月内进行。长时间保存样品容易使磷酸化蛋白去磷酸化而检测不到磷酸化条带。

7、提取胞浆、胞核蛋白的样品应尽量采用新鲜样品,因为冻存会使细胞浆、细胞核破裂。

8、血液样品(血浆中蛋白):3 000 rpm离心20 min后收集上清,分装后于-80度或者液氮冻存待用。3个月以内检测。

9、运输时间较长或长距离运送样品时采用干冰或者液氮。

 客户western blot 样本要求:

1、样本量:组织样本,质量大于100mg;细胞样本,细胞数大于1×106

2、一抗自备,也可让我公司代买,为保证质量,抗体最好为原装进口单克隆或多克隆抗体;

3、服务周期和内容:收到样本之日起15-20个工作日内提交实验结果,具体包括实验方法、步骤、所用试剂、仪器、胶片,图片及相关分析数据等;

4、报告送达:实验结果将以电子或书面形式提交给您。

实验结果展示:

InTech Western Blot  实验常规检测收费:

1.    样本处理费用:40元/样本(特殊样本询价);

2.    目的蛋白检测:1000元/膜/8样本(分子量≤30kDa或分子量≥200kDa询价)

3.    内参检测:赠送。

4.    磷酸化蛋白检测收费(询价)。

 

更多内容请咨询热线:021-64225729

E-mail:InTech@intechnology.cn

在线QQ技术支持:2869089062

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